Науковці створили з нуля цистеїнові протеази за допомогою обчислювального дизайну
Науковці створили з нуля цистеїнові протеази та підтвердили їхню активність лабораторними методами.
Дослідники з Університету Вашингтона та інших установ створили з нуля цистеїнові протеази — ферменти, здатні розщеплювати білки. Роботу, виконану із застосуванням обчислювального дизайну білків, опублікував Nature.
Цистеїнові протеази використовують цистеїн у своєму активному центрі для розщеплення пептидних зв’язків. У дослідженні науковці розробили обчислювальний конвеєр, який поєднував моделі RFD2-MI, ProteinMPNN та AlphaFold 3. Розрахунковий процес включав багаторазовий відбір варіантів конструкцій і оптимізацію геометрії каталітичного центру.
Перевірка активності ферментів
Автори дослідили 69 створених конструкцій після очищення. Для скринінгу застосували електрофорез SDS-PAGE та високоефективну рідинну хроматографію із гель-фільтрацією. Як позитивний контроль використали протеазу TEV дикого типу, а негативним контролем був її варіант TEV C151A.
Продукти розщеплення додатково перевіряли методом рідинної хроматографії з мас-спектрометрією. У всіх проаналізованих випадках мас-спектри підтвердили розщеплення у спроєктованій ділянці. Заміна ключових каталітичних амінокислот — цистеїну, гістидину або залишку, що формує оксіаніонну ділянку, — дала змогу перевірити внутрішньомолекулярну активність конструкцій.
Структури та відкриті дані
Команда також визначила й проаналізувала кристалічні структури створених протеаз. Атомні координати та структурні фактори, отримані в роботі, передали до Protein Data Bank під кодами 9YNL, 9YNM, 9YOX, 9YOY, 9YOZ і 9YP0. Автори відкрили код, використаний для обчислювального дизайну й аналізу, а також код для обробки кінетичних даних і зображень клітин ссавців.
