У Nature описали метод великих змін ДНК за допомогою prime assembly
Nature описав prime assembly — підхід для цільового вбудовування та заміни великих фрагментів ДНК у людських клітинах.
У науковій статті, опублікованій у Nature, описано підхід prime assembly (PA), який дає змогу цілеспрямовано вбудовувати, замінювати та перебудовувати більші фрагменти ДНК у геномі людських клітин. Метод використовує інструменти CRISPR і прайм-редагування для створення ділянок, до яких можуть приєднуватися донорські послідовності ДНК.
Автори роботи застосували PA для перекодування екзонів, інтеграції трансгенів і масштабних геномних перебудов у кількох генетичних локусах. Технологія працювала в первинних людських CD3+ T-клітинах, CD34+ гемопоетичних стовбурових і прогеніторних клітинах, а також у клітинах, що не діляться.
Заміна ділянки гена TINF2
Як першу демонстрацію дослідники перекодували 106 пар основ у шостому екзоні гена TINF2 у клітинах K562. Ця ділянка містить DC-кластер: домінантні мутації посилення функції тут пов'язані з дуже короткими теломерами та синдромом недостатності кісткового мозку — дискератозом вродженим.
Перекодування не змінювало амінокислотну послідовність білка, але потенційно могло б охопити майже всі відомі патогенні мутації в цьому кластері. За використання синтетичних одноланцюгових донорів ДНК середня ефективність редагування становила 30,0%. Найвищий показник — 33,1% — отримали з 16 пмоль донорської ДНК, захищеної фосфоротиоатними зв'язками на обох кінцях.
Інгібування двох шляхів відновлення ДНК — негомологічного з'єднання кінців і мікрогомологічно-опосередкованого з'єднання — підвищувало співвідношення точних результатів PA до неточних у 4,1 раза, а при поєднанні інгібіторів — у 8,5 раза. Аналіз інтеграцій по всьому геному не виявив повторюваного, залежного від направляючих РНК позамішеневого вбудовування одноланцюгового донора.
Інтеграція великих трансгенів
Для цільової інтеграції трансгенів команда тестувала донори дволанцюгової ДНК із 3′-виступами та звичайні дволанцюгові донори. У клітинах K562 інтеграція гена eGFP у локус IL2RG сягала в середньому 21,2% клітин із флуоресцентним сигналом за використання модифікованих направляючих РНК та інгібіторів відновлення ДНК.
Метод також перевіряли для вставок у локуси TRAC, IL2RG і AAVS1. У AAVS1 дослідники інтегрували донори розміром від 3,1 до 12,1 кілобази, що містили гени стійкості до пуроміцину та PGK1-eGFP. Для донора завдовжки 9,1 кілобази середня частка eGFP-позитивних клітин становила 28,1%, а для 12,1 кілобази — 7,4%.
Під час перевірки точності з'єднань у дослідах із цільовою інтеграцією трансгенів частка точних прочитувань становила 93,4–99,3%, а після інгібування двох шляхів репарації перевищувала 99,5%. Автори зазначили, що PA може бути новим способом внесення середніх і великих генетичних модифікацій без потреби в індукованих нуклеазою дволанцюгових розривах ДНК.
